Analyse van openbare gegevens

Gegevens over SARS-CoV-2-afstammingslijnen en de datum waarop het monster werd genomen uit de sequenties die beschikbaar zijn uit Chili, werden verkregen van de Consorcio Genomas CoV2-site die beschikbaar is op https://auspice.cov2.cl/ncov/chile-global. Vaccinatiegegevens zijn verkregen uit openbare gegevens van het ministerie van Wetenschap, Technologie, Kennis en Innovatie, beschikbaar op: https://github.com/MinCiencia/Datos-COVID19 (Product 83).

Infectiviteitstest

Pseudogetypeerde virussen die verschillende SARS-CoV-2-spike-eiwitten dragen, werden bereid zoals we eerder beschreven¹². In het kort werden op HIV-1 gebaseerde SARS-CoV-2-pseudotypen geproduceerd in HEK293T-cellen door de pNL4.3-ΔEnv-Luc samen met de overeenkomstige pCDNA-SARS-CoV-2 Spike-coderende vector in een molaire verhouding van 1:1 te transfecteren. Plasmiden die coderen voor een codon-geoptimaliseerde piek die de laatste 19 aminozuren van het C-terminale uiteinde (SΔ19) mist waarvan bekend is dat ze retentie bij het endoplasmatisch reticulum voorkomen¹² werden verkregen door gensynthese of aangepaste plaatsgerichte mutagenese (GeneScript) en bevatten de volgende mutaties: afstamming A (referentiesequentie), afstamming B (D614G), afstamming B.1.1.7 (Δ69-70, Δ144, N501Y, A570D, D614G, P681H, T716I, S982A, D1118H), afstamming P.1 (L18F, T20N, P26S, D138Y, R190S, K417T, E484K, N501Y, D614G, H655Y, T1027I) en afstamming C.37 (G75V76-I, ) 246, L252Q, F452S, D490G, T614N). Elk pseudotypepreparaat werd geklaard door centrifugatie bij 859 rpm bij kamertemperatuur, gekwantificeerd met behulp van de HIV-3,000 Gag p1 Quantikine ELISA Kit (R&D Systems), verdeeld in 24% foetaal runderserum (Sigma-Aldrich) en bewaard bij -50 °C tot gebruik maken van. Verschillende hoeveelheden pseudogetypeerde virussen (zoals bepaald door de niveaus van het HIV-80 p1-eiwit) werden gebruikt om HEK-ACE24-cellen te infecteren en 2 uur later werd de luciferase-activiteit van vuurvliegjes gemeten met behulp van het Luciferase Assay Reagent (Promega) in een Glomax 48 Microplate lichtmeter (Promega).

Neutralisatietest

Pseudogetypeerde virusneutralisatie-assays werden in wezen uitgevoerd zoals we eerder beschreven¹². In het kort werden seriële verdunningen van de plasmamonsters (1:4 tot 1:8748) bereid in DMEM met 10% foetaal runderserum en geïncubeerd met 5 ng p24 van elk pseudogetypeerd virus gedurende 1 uur bij 37 ° C en vervolgens 1 x 10⁴ van HEK-ACE2-cellen werden aan elk putje toegevoegd. HEK293T-cellen (die geen ACE tot expressie brengen2), geïncubeerd met het pseudo-getypeerde virus (afstamming A) werden gebruikt als een negatieve controle. De cellen werden 48 uur later gelyseerd en de luciferase-activiteit van de vuurvlieg werd gemeten met behulp van het Luciferase Assay Reagent (Promega) in een Glomax 96 Microplate-luminometer (Promega). Het neutralisatiepercentage voor elke verdunning werd berekend en de ID50 van elk monster werd berekend met GraphPad Prism versie 9.0.1.

statistische analyse

Statistische analyses werden uitgevoerd met GraphPad Prism-softwareversie 9.1.2. Vergelijkingen van meerdere groepen voor neutraliserende antilichaamtiters (NAbT's) tegen een panel van SARS-CoV-2 pseudo-getypeerde virussen, evenals vergelijkingen van NAbs-reacties per geslacht en rookstatus werden uitgevoerd met behulp van een gepaarde Wilcoxon-test met ondertekende rangschikking. Factorverandering werd berekend als het verschil van de geometrische gemiddelde titer in de ID₅₀ vergeleken met die van het wildtype pseudo-getypeerde virus. Correlatieanalyse tussen NAbT's en leeftijd of BMI werd uitgevoerd met behulp van Spearman's test. One-way ANOVA en Tukey's meervoudige vergelijkingstest werden uitgevoerd voor statistische analyse van besmettelijkheid. Een p-waarde ≤0.05 werd als statistisch significant beschouwd.

Ethische goedkeuring

Het onderzoeksprotocol is goedgekeurd door de ethische commissie van de faculteit geneeskunde van de Universidad de Chile (projecten nr. 0361-2021 en nr. 096-2020) en Clínica Santa Maria (project nr. 132604-21). Alle donoren ondertekenden de geïnformeerde toestemming en hun monsters werden geanonimiseerd.

Impact van de piekmutaties in de Lambda-variant op infectiviteit en neutraliserende antilichaamreacties

Een analyse van 3695 sequenties uit Chili gedeponeerd bij GISAID per 24 juni^th 2021 toont een duidelijke dominantie van de SARS-CoV-2-varianten Gamma en Lambda tijdens het laatste trimester, samen goed voor 79% van alle sequenties.

Interessant is dat deze periode werd gekenmerkt door een massale vaccinatiecampagne waarbij 65.6% van de doelpopulatie (18 jaar en ouder) op 27 juni een volledig vaccinatieschema heeft gekregen.^th 2021

Aangezien 78.2% van de mensen die met een volledig schema waren ingeënt, het geïnactiveerde virusvaccin CoronaVac van Sinovac Biotech ontvingen, probeerden we de impact te onderzoeken van de spike-mutaties die aanwezig zijn in de Lambda-variant op het neutraliserende vermogen van antilichamen die door dit vaccin worden opgewekt.

Hiervoor hebben we op HIV-1 gebaseerde SARS-CoV-2 pseudo-getypeerde virussen gegenereerd die het spike-eiwit dragen van de Wuhan-1-referentielijn (Wild type; lijn A), de D614G-mutatie (lijn B) en de Alpha (lijn B .1.1.7), Gamma (stam P.1) en Lambda (stam C.37) varianten.

Tijdens de virusbereiding hebben we consequent waargenomen dat cellen die zijn geïnfecteerd met het pseudo-getypeerde virus dat de Lambda-spike draagt, significant hogere bioluminescentiewaarden produceerden in vergelijking met de D614G-mutant of de Alpha- en Gamma-varianten, wat wijst op een verhoogde infectiviteit die wordt aangedreven door het Lambda-spike-eiwit.

Figuur 1.Infectiviteit gemedieerd door verschillende spike-eiwitten.

(A) Schematische weergave van het SARS-CoV-2 spike-eiwit en de varianten die in deze studie zijn gebruikt. De geslachten zijn tussen haakjes aangegeven. RBD, receptorbindend domein, CM; cytoplasmatische staart.

(B) Titratie van de pseudotypen van elke afstamming met behulp van equivalente hoeveelheden HIV-1 p24. De luciferase-activiteit van de vuurvlieg werd 48 uur na infectie gemeten als relatieve luminescentie-eenheden (RLU). Het gemiddelde en de SD werden berekend op basis van een representatief experiment in drievoud.

Vervolgens hebben we de hierboven genoemde pseudo-getypeerde virussen gebruikt om neutralisatietesten uit te voeren met 79 plasmamonsters van gezonde gezondheidswerkers van de Universidad de Chile en Clínica Santa María in Santiago, Chili.

We hebben 4 monsters uitgesloten omdat we geen ID50-titer konden berekenen. Van de geanalyseerde monsters kwam 73% overeen met vrouwen, mediane leeftijd 34 jaar (IQR 29 – 43) en een body max index (BMI) van 25 (IQR 22.7 – 27). 20.5% van de deelnemers verklaarde actief te roken zolang de vaccinatieperiode duurde. Monsters werden genomen in een mediaan van 95 dagen (IQR 76 – 96) na de tweede dosis van het CoronaVac-vaccin

We hebben waargenomen dat neutralisatie van het pseudo-getypeerde virus dat het Wild-type spike-eiwit draagt, resulteerde in een 50% remmende verdunning (ID₅₀) gemiddelde titer van 191.46 (154.9 – 227.95, 95% BI,), terwijl deze 153.92 (115.68 – 192.16, 95% BI), 124.73 (86.2 – 163.2; 95% BI), 104.57 (75.02 – 134.11, 95% BI) was ) en 78.75 (49.8 – 107.6, 95% CI) voor pseudogetypeerde virussen die respectievelijk het spike-eiwit van de D614G-mutant of de Alpha-, Gamma- en Lambda-varianten dragen.

We hebben ook waargenomen dat de geometrische gemiddelde titer van de ID₅₀ titers daalden met een factor 3.05 (2.57 – 3.61, 95% BI) voor het pseudo-getypeerde virus dat de Lambda-piek draagt, 2.33 (1.95 – 2.80, 95% BI) voor de Gamma-piek, 2.03 (1.71 – 2.41, 95% BI) voor de Alpha-piek en 1.37 (1.20 – 1.55, 95% CI) voor de D614G-piek in vergelijking met de Wild-typepiek.

In ons studiecohort werd geen correlatie waargenomen tussen geslacht, leeftijd, body-mass index (BMI) of rookstatus en neutraliserende antilichaamtiters.

Figuur 2.Neutralisatietest met plasmamonsters van CoronaVac-gevaccineerden

(A) Veranderingen in de wederzijdse neutralisatietiter van 50% (ID₅₀) in plasmamonsters van 75 ontvangers van het CoronaVac-vaccin tegen de D614G (lijn B), Alpha (lijn B.1.1.7),

Gamma (afstamming P.1) en Lambda (afstamming C.37) varianten in vergelijking met wildtype virus. Resultaten worden weergegeven als het verschil in neutralisatietiters van gematchte monsters. P-waarden voor de vergelijking van de ID₅₀ worden berekend met de Wilcoxon-ondertekende rangtest.

(B) Boxplots gaven de mediaan en interkwartielafstand (IQR) van ID . aan₅₀ voor elk pseudogetypeerd virus. Factorveranderingen worden weergegeven als het verschil van de geometrische gemiddelde titer in de ID₅₀ vergeleken met die voor het wildtype pseudo-getypeerde virus. Statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van de Wilcoxon-matched-pairs-signed-rank-test.

Samen onthulden onze gegevens dat het spike-eiwit van de nieuw erkende variant van interesse Lambda, die sterk circuleert in Chili en Zuid-Amerikaanse landen, mutaties draagt die zorgen voor verhoogde besmettelijkheid en het vermogen om te ontsnappen aan neutraliserende antilichamen die worden opgewekt door CoronaVac.